转化(transformation)

细菌的基因转移与重组是指遗传物质由供体菌转移给受体菌,并与受体菌的基因进行整合,使受体菌得供体菌某些遗传性状的过程。这种基因转移的方式也被称为基因水平转移(horizontal ggene transfer, HGT)。HGT 可发生在亲缘、远缘甚至无亲缘关系的生物之间。相对于基因的垂直转移, HGT 打破了亲缘关系的界限,加速了细菌基因组的进化,促使细菌获得更多的遗传多样性,不断产生新型病原菌和流行亚型。
基因重组的方式有同源重组(homologous recombination)非同源重组(nonhomologous recom- bination)两种。

  • 同源重组发生在具有共同起源且序列相同或相近的供体和受体 DNA基因片段之间,在细菌 ree 基因编码的重组酶作用下,由外源性单链 DNA 取代宿主菌染色体上的DNA。这种重组方式可在受体-供体间双向交换 DNA 片段,也可单向转移DNA 片段,后者也称为基因转换(gene conversion);
  • 非同源重组不需要 DNA片段间的同源性,在位点专一重组酶作用下即可将缺失或插入的DNA 重新连接,如转座子或前噬菌体基因组的插入重组。根据 DNA 片段的来源及交换方式等不同, 基因转移和重组的方式被分为转化、接合和转导等方式。

受体菌直接摄取供体菌游离 DNA 片段并整合到受体菌的基因组中,使受体菌获得新遗传性状的基因转移方式。

转化条件及影响因素

转化的首要条件是受体菌处于能从周围环境中摄取 DNA 分子的状态,即感受态(competence)。感受态细菌常表现为表面带正电荷、表达 DNA 结合蛋白、细胞膜通透性增高等特点,一般出现在细菌对数生长后期,持续时间从数分钟到数小时不等。如肺炎链球菌感受态就出现在其对数生长后期,可维持40分钟。只有少数菌属可自然呈现感受态,如肺炎链球菌、枯草芽胞杆菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌等。
细菌的感受态也可通过人工诱导,如将对数生长期的大肠埃希菌用低渗CaCl2或 MgSO,等处理,然后移至 42°C下作短暂的热激活,可促进细菌对外源性 DNA 的摄取。此外,电穿孔法也能让某些不具备转化能力的细菌获得摄取 DNA 的能力。

影响转化的因素

  1. 供、受体菌的同源性:两菌的亲缘关系愈近,其基因型愈相似,转化率愈高。如果供、受体菌基因组无同源性,摄入的 DNA 片段会被降解。
  2. 转化因子的大小、构型等:转化因子为 dsDNA 分子,一般不超过10~20个基因。
  3. 受体菌的生理状态:受体菌处于感受态才易于摄人外源 DNA片段,感受态细菌结合 DNA 的能力是非感受态细菌的1000倍。
  4. 环境因素:Ca' Mg 、cAMP等可维持 DNA的稳定性,促进转化作用。

转化过程

外源性 DNA 黏附于处于感受态的受体菌细胞表面,其 dsDNA 中的一条链被降解消化,产生的能量促使另一条互补链进入受体菌。进人的单链 DNA与受体菌染色体的同源部位发生重组,形成异源双链区。随着染色体复制、细胞分裂后产生两个子细胞,一个保持原受体菌的性状,另一个则成为带有供体菌性状的转化细菌。

接合(conjugation)

通过性菌毛的相互连接沟通,供体菌将遗传物质(主要是质粒DNA)传递给受体菌,使受体菌获得新遗传性状的基因转移方式。通过接合方式转移的质粒被称为接合性质粒,包括F质粒、R质粒、Col质粒、毒力质粒、代谢质粒等。接合作用广泛存在于革兰氏阴性菌中,在某些革兰氏阳性菌(如链球菌、枯草芽胞杆菌)中也有报道。
细菌接合的过程较复杂。接合性质粒携带约33kbp 大小的 tra 基因簇(tra and trb locus),编码约40个基因产物,参与质粒的接合转移过程,包括:发挥不相容性,使F质粒不能转移至 F+ 菌;参与性菌毛的合成和组装;维持细菌接合桥的稳定性;切割解旋质粒 DNA 链,并促使转移链进人受体菌。有些接合性质粒还可介导非接合性质粒或部分染色体的传递。

F质粒

F质粒编码性菌毛,

  • 含F质粒的细菌被称为F+菌(雄性菌),接合时作为供体菌;
  • 不含F质粒、无性菌毛的细菌被称为F-菌(雌性菌),接合时为受体菌。
    F+菌和F-菌接合时,F+菌性菌毛首先与F-菌表面受体接合形成通道,F质粒在 orit 位点被切割形成单链缺口,线性化单链 DNA 经性菌毛接合桥进入F-菌内,整个转移过程只需1分钟。供、受体菌细胞内的单链 DNA 分别以滚环模式进行复制,各自形成完整的双链F质粒。因此,供体菌虽然转移了F质粒,但并未失去F质粒, 仍为F+菌;受体菌通过接合获得F质粒,成为 F+菌,并获得F质粒基因编码的生物学性状。

高频重组株

有时,少数F质粒亦可整合到细菌染色体上,与染色体一起复制,整合后的细菌能通过接合方式高频率转移宿主菌染色体上的基因,被称为高频重组株(high frequency recombinant, Hfr)。Hfr 菌亦能编码性菌毛,可作为接合的供体菌。当Hfr 菌与F-菌接合时,首先从转移起始点开始,F质粒牵动Hfr 菌染色体单链进入F- 菌。
由于全部染色体转移约需100分钟,而细菌间的接合桥在接合过程中易受外界因素影响发生断裂,故Hfr 菌与F-菌的接合会出现不同长度的供体菌染色体片段进入受体菌,进行重组。F质粒位于染色体链的末端,最后才能进人受体菌,因此,受体菌获得Hf 菌完整F质粒的概率很低。根据DNA转移链的中断时间点和受体菌获得的新性状,可进行基因定位,绘制细菌基因图谱。

F质粒在HG菌中的整合是可逆的,有时会从染色体上脱离,终止细菌 Hfr状态。自染色体上脱离的F质粒有时会携带整合位点相邻的染色体 DNA 片段,被称F'质粒。带有F'质粒的F'菌也可以作接合的供体菌。F'菌与F-菌接合的过程和F+菌与F-菌的接合过程相同,F'质粒转入F-菌使其成F-菌,原来的F'菌仍然是F'菌。如携带乳糖发酵酶基因的FVac 质粒,通过接合方式转移至不发酵乳糖的菌株中,受体菌可获得发酵乳糖的性状。因此,F'质粒具有类似基因转导中温和噬菌体的基因载体作用。

R质粒

R质粒为接合性耐药质粒,在细菌耐药性的转递中发挥重要作用。
R 质粒由

  • 耐药传递因子(resistance transfer factor, RTF)
  • 耐药决定子(resistance determinant, r-det )
    组成。
    RTF 的功能与F质粒相似,编码性菌毛,决定质粒的复制、接合及转移;r-det 则决定菌株的耐药性。RTF 和 r-det 可整合在一起,也可单独存在,但单独存在时无接合传递耐药基因的功能。 r-det 可带有多个不同耐药基因的转座子,如由 T4、Th5 和Th9 组成的r-det 就携带氨苄西林、链霉素、磺胺、卡那霉素、博来霉素和氯霉素等耐药基因,使细菌出现多重耐药性。R质粒可通过接合方式在相同或不同种属的细菌间传递,导致细菌耐药性的迅速传播和耐药菌株不断增加,这种现象在革兰氏阴性菌中最为突出。R质粒还可诱导非接合性耐药质粒的传递,也被称为传染性耐药因子。

转导(transduction)

转导指通过噬菌体介导,将供体菌的 DNA 片段转入受体菌,重组后使受体菌获得新遗传性状的基因转移方式。转导在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中均可发生。与转化相比,转导可转移更大片段的DNA,而且由于 DNA片段被包装在噬菌体头部,可免受 DNA 酶的降解,因此,转导的效率更高。转导分为普遍性转导和局限性转导。

普遍性转导(general transduction)

噬菌体成熟装配过程中,由于装配错误,可能误将宿主菌(供体菌)的染色体片段或质粒 DNA 装入噬菌体内,产生特殊的转导噬菌体(transducing phage)。当转导噬菌体感染其他细菌(受体菌)时,便将供体菌 DNA 转入受体菌。大约每10°~10’次装配中会发生一次错误,且包装是随机的,供体菌的任何 DNA片段都有可能被误装入噬菌体内,故称普遍性转导。毒性噬菌体和温和噬菌体均可介导普遍性转导。普遍性转导可产生两种结果:一种是供体菌 DNA 片段通过同源重组整合至受体菌染色体中,并随染色体复制而稳定遗传,称为完全转导; 另一种是供体菌 DNA片段始终游离在受体菌细胞质中,不能自身复制,也不能传代,称为流产转导(abortive transduction)。普遍性转导是金黄色葡萄球菌中耐药传递的主要方式,由于噬菌体具有宿主特异性,故耐药性转导的现象主要发生在同种细菌之间。

局限性转导(restricted transduction)

温和噬菌体进入溶原末期,整合在细菌染色体上的前噬菌体可自发或经诱导后从宿主菌染色体上脱离。前噬菌体的切离通常较精准,但偶尔会发生错误切离,可能携带着其紧密连接的宿主菌染色体基因一起脱落,经复制、转录和翻译后组装成转导噬菌体。这种转导噬菌体再感染其他细菌(受体菌)时,可将供体菌基因带入受体菌,整合到受体菌的染色体上并表达出新的遗传性状。例如入温和噬菌体常整合在大肠埃希菌染色体的半乳糖苷酶基因(gal)与生物素基因(bio)之间,在切割脱离时约有10-°概率会发生偏差脱落,带走两侧的gal或bio 基因,并转入受体菌。
由于被转导的基因只限于前噬菌体两侧的供体菌基因,故称局限性转导。

普遍性转导(General Transduction) 局限性转导(Restricted Transduction)
定义 噬菌体在成熟装配过程中,由于装配错误,将宿主菌的任意染色体片段或质粒 DNA 随机装入噬菌体内,并转导至其他细菌。 温和噬菌体在从宿主菌染色体切离时发生错误,携带其整合位点附近的宿主菌染色体片段,并将其转导至其他细菌。
噬菌体类型 毒性噬菌体和温和噬菌体均可介导普遍性转导。 仅由温和噬菌体介导。
DNA 包装机制 噬菌体装配过程中随机误装宿主菌 DNA,任何供体菌的 DNA 片段都有可能被转导。 前噬菌体从宿主菌染色体切离时发生错误,仅携带前噬菌体两侧紧邻的宿主菌基因片段。
转导 DNA 的范围 随机,供体菌的任何 DNA 片段均可被转导。 局限于前噬菌体整合位点两侧的宿主菌基因。
发生概率 大约每 (10^6) 至 (10^8) 次装配中发生一次错误。 切离过程中发生错误的概率较低,约为 (10^{-6})。
转导结果 1. 完全转导:供体菌 DNA 通过同源重组整合到受体菌染色体中,并稳定遗传。
2. 流产转导:供体菌 DNA 片段在受体菌中游离,不能复制或传代。
转导的供体菌基因通过同源重组整合到受体菌染色体中,并表达出新的遗传性状。
主要功能 1. 基因多样性增加。
2. 是金黄色葡萄球菌等细菌中耐药性基因传递的主要方式,通常发生在同种细菌之间。
1. 转导供体菌的特定基因(如代谢相关基因)至受体菌。
2. 常涉及噬菌体整合位点附近的特定基因(如大肠杆菌的 gal 或 bio 基因)。

细菌遗传变异在医学上的应用

一、生物学性状变异与细菌学诊断

细菌形态结构、染色性、菌落特点、生化反应和抗原性等均是细菌学诊断的重要依据,如果发生变异,可能给细菌学诊断带来困难。如L型变异会导致细菌形态结构、染色性、培养特性等发生改变,伤寒沙门菌发生H-0变异可表现为动力试验阴性且血清中无抗鞭毛抗体等。因此,在细菌学诊断中, 应充分考虑到细菌变异问题,方可作出准确诊断。此外,随着分子生物学技术发展,选取细菌保守、稳定且具有种特异性的基因组片段,利用PCR 和测序等快速诊断方法进行细菌鉴定,可用于不易培养或生长缓慢细菌的鉴定。

二、耐药性变异与抗生素使用

由于耐药性变异及耐药基因的水平传递,加之临床和饲料使用抗生素的筛选作用,耐药性细菌不断增加,且出现耐多种抗菌药物的菌株(如MRSA等),导致耐药菌在临床和社区扩散流行,给疾病治疗带来很大困难。为提高抗菌药物的疗效,防止耐药菌株扩散,临床上常用药物敏感试验指导抗菌药物的选择和合理使用。还可通过耐药监测、耐药机制研究等手段控制耐药菌的产生和扩散。

三、毒力变异与疫苗研发

利用毒力变异原理使细菌毒力减弱而保留免疫原性,可制成减毒活疫苗,如炭疽芽胞杆菌减毒活疫苗、卡介苗等,在相应疾病的预防中均得到广泛应用。随着细菌全基因组测序工作的推进,以及人工定点突变、基因敲除等技术的日益成熟,会有更多人工减毒活疫苗应用于疾病预防。但也要警惕和防范恐怖组织利用细菌毒力变异的原理,通过增强细菌毒力,制备生物武器或恐怖制剂。

四、营养缺陷型变异与致癌物质检测

化学诱变剂可引起基因突变,凡能诱导细菌突变的物质也可能诱发人体细胞突变,是潜在的致癌物质。1975年,布鲁斯•埃姆斯(Bruce Ames)等根据上述原理建立了 Ames 试验。该试验以鼠伤寒沙门菌的组氨酸营养缺陷型(his)为受试菌,通过检测细菌的诱发突变率,对可疑致癌物进行检测。

五、细菌分类鉴定和流行病学调查方面的应用

随着基因组学的快速发展,根据细菌基因序列特征,采用16S rDNA 鉴定、质粒谱分析、脉冲场凝胶电泳、限制性片段多态性分析、基因组测序等分子生物学方法,可对细菌进行鉴定与分类、感染性疾病的流行病学调查、病原体的溯源与追踪、细菌耐药性和基因功能的分析与研究。

六、基因工程方面的应用

基因工程(gene engineering)是利用生物遗传密码的通用性和基因可转移与重组的原理建立的DNA 体外重组技术。该技术打破了生物种属间的界限,使微生物、动植物甚至人类之间的遗传物质可以相互转移和重组,以达到生产生物活性物质、制备疫苗、治疗疾病等目的。目前许多不易从天然生物体内大量获取的生物活性物质,如胰岛素、白介素、干扰素、生长激素和凝血因子等都可采用基因工程大量生产。基因工程疫苗和 mRNA疫苗的研制也取得了重要进展,对疾病的特异性防治起到积极的推动作用。此外,由细菌 CRISPR/Cas 系统介导的基因编辑技术可用于制备转基因模型、基因功能研究和基因治疗等,并有望解决细菌耐药的难题。然而,值得注意的是基因工程技术是把双刃剑, 外源性基因的插人具有不确定性,也可能造成不良后果。因此,必须遵循2017年科技部制定的《生物技术研究开发安全管理办法》,对相应工作进行严格风险评估和管理。